納米酶因其高穩(wěn)定性和可調(diào)的類(lèi)酶活性，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。其中，鉑（Pt）基納米酶尤為突出，它不僅兼具過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，可用于催化治療，還表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換性能與出色的穩(wěn)定性，已成為癌癥治療研究的熱點(diǎn)。然而，腫瘤微環(huán)境（TME）的弱酸性、缺氧、高谷胱甘肽（GSH）水平及低內(nèi)源性H2O2等特征，嚴(yán)重制約了Pt基納米酶的催化效率及治療效果。同時(shí)，光熱治療（PTT）誘導(dǎo)的熱休克蛋白90（HSP90）過(guò)度表達(dá)，會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的耐熱性，進(jìn)而削弱光熱療效。因此，通過(guò)設(shè)計(jì)優(yōu)化Pt基納米酶的催化性能、調(diào)控腫瘤微環(huán)境以提升催化效率，并抑制熱休克蛋白表達(dá)以增強(qiáng)光熱治療（PTT）效果，有望成為腫瘤治療的一種有效策略。
基于此，東華大學(xué)史向陽(yáng)教授/郭睿教授團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種基于 CuPt 雙金屬納米酶與糖酵解抑制劑氯尼達(dá)明（Lon）協(xié)同作用的納米治療平臺(tái)（CPL@G5-BS），旨在通過(guò)調(diào)控 TME 實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的光熱治療（PTT）與催化治療（圖1）。研究團(tuán)隊(duì)首先在部分乙；牡 5 代 PAMAM 樹(shù)狀大分子（G5）表面修飾碳酸酐酶 IX（CA IX）抑制劑——對(duì)羧基苯磺酰胺（BS），構(gòu)建了載體 G5-BS。CA IX 作為一種在腫瘤細(xì)胞表面過(guò)度表達(dá)的膜蛋白，在腫瘤增殖和侵襲中起關(guān)鍵作用，是極具潛力的治療靶點(diǎn)。BS 修飾的載體 G5-BS 能夠被 CA IX 過(guò)表達(dá)的 4T1 腫瘤細(xì)胞高效攝取，并通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的pH“內(nèi)降外升”來(lái)增強(qiáng)催化治療效果，同時(shí)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。隨后，通過(guò)在樹(shù)狀大分子 G5-BS 內(nèi)部原位還原 K2PtCl4 和 CuCl2·2H2O 負(fù)載 CuPt 納米酶，并物理包封 Lon，最終制備得到納米平臺(tái) CPL@G5-BS。構(gòu)建 CuPt 雙金屬納米酶不僅可以顯著增強(qiáng)·OH 的生成并消耗 GSH，從而進(jìn)一步提升化學(xué)動(dòng)力療法（CDT）的療效，還能夠進(jìn)一步提高納米顆粒的光熱轉(zhuǎn)換效率、增強(qiáng)光熱治療效果。與此同時(shí)，負(fù)載的 Lon 能夠通過(guò)抑制 HSP90 的表達(dá)顯著增強(qiáng)光熱治療效果，并通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞的氧氣消耗，與納米酶的類(lèi)過(guò)氧化氫酶（CAT）活性協(xié)同作用，共同緩解腫瘤乏氧。因此，CPL@G5-BS 納米平臺(tái)能夠通過(guò)調(diào)控 TME 實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)的光熱/催化聯(lián)合治療，為開(kāi)發(fā)新型癌癥治療策略提供了一個(gè)有前景的平臺(tái)。
圖1. CPL@G5-BS用于腫瘤微環(huán)境調(diào)控光熱/催化療法的機(jī)制示意圖。
1H NMR和UV-vis證明了雜化納米平臺(tái)的成功合成（圖2a-b）。TEM結(jié)果顯示納米酶呈現(xiàn)均勻球形，平均粒徑為1.45 nm（圖2c-d）。XPS圖譜顯示Pt和Cu以多種價(jià)態(tài)共存（圖2e-f）。藥物釋放曲線(xiàn)顯示Lon在pH 5.5時(shí)釋放量更高，說(shuō)明其具有pH響應(yīng)性（圖2g）。最終材料的水合粒徑在7天內(nèi)沒(méi)有明顯變化，證明其具有良好的膠體穩(wěn)定性（圖2h）。此外，CPL@G5-BS具有良好的血液相容性，表明其具有安全生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的潛力，能夠用于后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（圖2i）。
圖2.（a）G5.NHAc和G5.NHAc-BS的1H NMR譜圖。（b）G5、G5.NHAc、G5.NHAc-BS、CP@G5-BS、Lon及CPL@G5-BS的UV-Vis吸收光譜。（c）CPL@G5-BS的TEM圖像及（d）對(duì)應(yīng)的尺寸分布直方圖。CPL@G5-BS的（e）Pt 4f和（f）Cu 2p高分辨率XPS譜圖。(g) 不同pH條件下Lon的釋放行為。(h) CPL@G5-BS分散于不同介質(zhì)中7天后的水合粒徑變化。(i) 用Water、PBS及CPL@G5-BS（[G5] = 6、12、24、36、48 μM）處理后的紅細(xì)胞溶血率和圖像。
團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了CPL@G5-BS 的光熱性能及酶催化特性。光熱研究結(jié)果顯示在激光照射下，CPL@G5-BS溶液溫度與濃度呈正相關(guān)且具有高光熱穩(wěn)定性（圖3a-b）。此外， Cu 摻雜可以增強(qiáng)其光熱性能（圖3c）。團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探究了Cu摻雜及光熱效應(yīng)對(duì)CPL@G5-BS類(lèi)酶活性的影響。CPL@G5-BS的類(lèi)SOD酶活性超過(guò)PL@G5-BS，且在激光照射下進(jìn)一步增強(qiáng)（圖3d）。TMB氧化反應(yīng)證實(shí)了CPL@G5-BS的POD酶活性（圖3e）。在激光照射下，POD酶活性因溫度升高而增強(qiáng)（圖3f）。在弱酸性條件下其具有最強(qiáng)的POD酶活性（圖3g）。催化動(dòng)力學(xué)結(jié)果進(jìn)一步證明了其優(yōu)異的類(lèi)POD酶活性（圖3h-i）。除此之外，CPL@G5-BS還表現(xiàn)出優(yōu)異的類(lèi)CAT酶活性（圖3j-k）？傊CPL@G5-BS在銅摻雜和激光照射下表現(xiàn)出優(yōu)異的光熱性能、類(lèi)SOD、POD和CAT酶活性。能夠在腫瘤部位持續(xù)產(chǎn)生ROS和O2，說(shuō)明CPL@G5-BS在癌癥治療方面的巨大潛力（圖3l）。
圖3.（a）不同濃度CPL@G5-BS溶液在1064 nm激光（0.6 W·cm-2）照射10分鐘下的溫度變化。（b）CPL@G5-BS溶液（[Pt] = 100 μg·mL-1）在1064 nm激光（0.6 W·cm-2）下的循環(huán)加熱曲線(xiàn)。（c）PL@G5-BS與CPL@G5-BS在不同濃度下的溫度變化對(duì)比。（d）不同處理組的SOD酶活性。（e）pH 5.5條件下，不同溶液反應(yīng)15分鐘后的吸光光譜及溶液顏色變化。（f）CPL@G5-BS在有無(wú)激光照射下652 nm處的紫外吸收強(qiáng)度對(duì)比。（g）pH對(duì)CPL@G5-BS類(lèi) POD酶活性的影響。（h）CPL@G5-BS的米氏動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)及（i）Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖。（j）pH 6.5條件下，CPL@G5-BS與H2O2共存條件下的O2生成量。（k）不同處理組的類(lèi)CAT酶活性（[Pt] = 20 μg·mL-1）。（l）CPL@G5-BS光熱增強(qiáng)多酶活性的機(jī)制示意圖。
研究團(tuán)隊(duì)選用4T1細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示CPL@G5-BS+Laser組對(duì)4T1細(xì)胞具有最佳的殺傷效果（圖4a-b）。細(xì)胞吞噬驗(yàn)證BS介導(dǎo)的靶向作用促進(jìn)了對(duì)材料的攝取（圖4c-f）。pH檢測(cè)結(jié)果顯示BS能夠有效抑制CA IX的活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)pH降低、提升催化效率，并減少細(xì)胞外基質(zhì)酸性、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移（圖4g-h）。
圖4.（a）不同材料對(duì)4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)估。（b）不同處理對(duì)4T1細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)估。（c）4T1細(xì)胞與不同材料孵育后細(xì)胞內(nèi)的Pt含量。（d）4T1細(xì)胞與PBS、GPL@G5、Blocked-CPL@G5-BS和CPL@G5-BS復(fù)合物孵育6小時(shí)后的CLSM圖像（GPL@G5和CPL@G5-BS用Cy5.5標(biāo)記）。（e）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同條件培養(yǎng)后4T1細(xì)胞中Cy5.5的滯留情況和（f）平均熒光強(qiáng)度。 (g) 不同處理4小時(shí)后BCECF染色的4T1細(xì)胞CLSM圖像。（h）不同處理?xiàng)l件下4T1細(xì)胞遷移的劃痕實(shí)驗(yàn)圖像。在（d）和（g）中，標(biāo)尺 = 20 μm。在（h）中, 標(biāo)尺 = 500 nm。
隨后，研究團(tuán)隊(duì)探究了CPL@G5-BS的體外抗腫瘤機(jī)制。CPL@G5-BS+Laser組誘導(dǎo)了最顯著的ROS產(chǎn)生、GSH耗竭和LPO積累（圖5a-d）。由于活性氧的積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激和線(xiàn)粒體損傷的惡性循環(huán)，研究團(tuán)隊(duì)采用JC-1評(píng)估了線(xiàn)粒體膜電位。CPL@G5-BS組幾乎沒(méi)有紅色熒光，表明催化治療和PTT的組合加劇了線(xiàn)粒體損傷（圖5e）。
圖5.（a）流式細(xì)胞儀分析 4T1 細(xì)胞經(jīng)不同處理 4 小時(shí)后的細(xì)胞內(nèi) ROS 水平和（b）定量分析。（c）不同處理4小時(shí)后4T1細(xì)胞內(nèi)GSH的相對(duì)水平。（d）通過(guò)CLSM觀(guān)察不同處理4 h后4T1細(xì)胞中LPO的表達(dá)水平。（e）4T1細(xì)胞經(jīng)不同處理后的JC-1染色。在（d）和（e）中，標(biāo)尺 = 20 μm。
團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步評(píng)估了Lon對(duì)于腫瘤細(xì)胞能量代謝的抑制作用。CPL@G5-BS+Laser組腫瘤細(xì)胞缺氧得到明顯緩解（圖6a），ATP水平顯著下降（圖6b），HSP90表達(dá)顯著降低（圖6c-d）。此外，活/死染實(shí)驗(yàn)證實(shí)了CPL@G5-BS在激光照射下對(duì)4T1細(xì)胞的有效消融。CPL@G5-BS+Laser表現(xiàn)出最高水平的細(xì)胞死亡，證實(shí)了PTT和催化治療的協(xié)同效應(yīng)（圖6e）。圖6f闡明了CPL@G5-BS的體外抗腫瘤機(jī)制。在其被4T1細(xì)胞特異性攝取后，可通過(guò)多酶活性顯著促進(jìn)ROS生成、消耗GSH、緩解腫瘤缺氧。同時(shí)，Lon可以抑制O2消耗、降低ATP水平、抑制HSP90的表達(dá)，從而克服癌細(xì)胞的耐熱性。在激光照射下，CPL@G5-BS表現(xiàn)出優(yōu)異的PTT性能和增強(qiáng)的CDT，從而獲得優(yōu)異的治療效果。
圖6.（a）使用[Ru(dpp)3]2+Cl2探針檢測(cè)不同處理后4T1細(xì)胞中的O2含量，標(biāo)尺 = 20 μm。（b）不同處理4小時(shí)后4T1細(xì)胞內(nèi)ATP的相對(duì)水平。HSP90表達(dá)水平的（c）WB分析和（d）定量結(jié)果。（e）不同處理后4T1細(xì)胞的Calcein-AM/PI雙染色圖像，標(biāo)尺 = 50 μm。（f）CPL@G5-BS的抗腫瘤機(jī)制。
研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了4T1荷瘤小鼠模型，按圖7a所示時(shí)間線(xiàn)進(jìn)行了體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。光熱成像顯示CPL@G5-BS治療組腫瘤部位溫度明顯高于對(duì)照組（圖7b）。治療結(jié)束后各組小鼠的體重均略有增加，表明材料均沒(méi)有明顯的毒性（圖7c）。且CPL@G5-BS+Laser治療組的腫瘤體積最小、重量最輕，說(shuō)明其具有最佳的腫瘤抑制效果（圖7d-f）。CPL@G5-BS+Laser組小鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)明顯減少，幾乎接近健康狀態(tài)，表明CPL@G5-BS具有顯著的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力（圖7g-h）。
圖7.（a）靜脈注射CPL@G5-BS治療4T1荷瘤小鼠的示意圖。（b）4T1 荷瘤小鼠在 1064 nm 激光照射（0.6 W cm-2）下接受不同治療后的紅外熱成像：Ⅰ）PBS、Ⅱ）CPL@G5、Ⅲ）CPL@G5-BS。不同治療后（c）小鼠體重和（d）相對(duì)腫瘤體積的變化。（e）各組切除腫瘤的照片和（f）重量：1）PBS、2）Lon、3）CPL@G5、4）CP@G5-BS、5）CPL@G5-BS、6）CPL@G5-BS + Laser（n = 6）（g）不同處理后第 14 天 4T1 荷瘤小鼠的代表性肺組織照片以及（h）相應(yīng)的 H&E 染色（標(biāo)尺 = 1 mm）。
為了比較分析不同治療組之間的腫瘤抑制效果，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)腫瘤組織切片進(jìn)行了H&E、TUNEL和Ki67 染色（圖 8a）。結(jié)果證明CPL@G5-BS+ Laser 組顯示出最顯著的腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡，以及最大的腫瘤細(xì)胞增殖抑制。免疫熒光染色結(jié)果顯示CPL@G5-BS+Laser處理的腫瘤中觀(guān)察到了最顯著的CA IX抑制、HIF-1α下調(diào)和HSP90抑制（圖8b）。
圖8.（a）各組腫瘤組織的 H&E、TUNEL 和 Ki67 染色。（b）不同處理后腫瘤切片的 CA IX、HIF-α、HSP90 染色。在（a）和（b）中，標(biāo)尺 = 50 μm。
簡(jiǎn)而言之，團(tuán)隊(duì)所構(gòu)建的CPL@G5-BS具有以下特點(diǎn)：1）在 Cu 摻雜和近紅外二區(qū)激光照射的共同作用下，CPL@G5-BS展現(xiàn)出增強(qiáng)的級(jí)聯(lián)催化活性；2）BS修飾使 CPL@G5-BS 在 4T1 腫瘤部位蓄積，并通過(guò)抑制 CA IX 活性實(shí)現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞內(nèi)、外 pH 逆轉(zhuǎn)，增強(qiáng)了催化治療效果并有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；3）Lon通過(guò)破壞腫瘤細(xì)胞能量代謝、下調(diào) HSP90，克服了 PTT中的熱抵抗效應(yīng)，同時(shí)減少 O2消耗緩解腫瘤乏氧TME。通過(guò)調(diào)控TME，這種多模式策略不僅促進(jìn)了激光照射下的有效PTT效果，而且增強(qiáng)了級(jí)聯(lián)催化治療，從而發(fā)揮了顯著的腫瘤抑制作用、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。
以上研究成果以“Dendrimer-Entrapped CuPt Bimetallic Nanozyme for Tumor Microenvironment Regulated Photothermal/Catalytic Therapy”為題，在線(xiàn)發(fā)表于國(guó)際著名期刊ACS Applied Materials & Interfaces (DOI: 10.1021/acsami.5c05324)。東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院郭睿教授與史向陽(yáng)教授為共同通訊作者，東華大學(xué)碩士研究生盧世轉(zhuǎn)為第一作者。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)等的資助。
論文信息：
Shizhuan Lu, Aiyu Li, Haoyu Huang, Cheng Ni, Xueyan Cao, Xiangyang Shi*, Rui Guo*. Dendrimer-Entrapped CuPt Bimetallic Nanozymes for Tumor Microenvironment-Regulated Photothermal/Catalytic Therapy. ACS Appl Mater Interfaces, 2025, 17: 30716-30730.
文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acsami.5c05324
