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  近年來，耐藥細(xì)菌的持續(xù)和快速出現(xiàn)與傳播對(duì)新型抗菌藥物研究提出了迫切需求。宿主防御肽因其廣譜抗菌活性且不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)而被作為有前景的抗耐藥菌感染藥物研究新思路被寄予厚望。然宿主防御肽的應(yīng)用受到易被蛋白酶水解、體內(nèi)穩(wěn)定性差、制備成本高等缺點(diǎn)的限制。因此，研究耐蛋白酶水解、合成方便且具有高效抗耐藥菌感染能力的宿主防御肽模擬物具有重要意義。

  近日，劉潤(rùn)輝教授課題組報(bào)道了一種對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等多種耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌具有高效抗菌活性和抗感染治療潛力的類肽聚合物。該研究成果以“Addressing MRSA Infection and Antibacterial Resistance with Peptoid Polymers”為題發(fā)表在Nature Communications上（Nat. Commun. 2021, 12, 5898）。

  作者通過α-NNCA的一鍋法開環(huán)聚合方便地制備具有不同C-端官能團(tuán)的抗菌類肽聚合物R-(Naeg)_n。優(yōu)選類肽分子HS(Naeg)₂₀對(duì) MRSA 等多種耐藥陽(yáng)性菌具有高效抗菌活性，對(duì)MRSA休眠細(xì)菌和對(duì)抗生素高度耐藥的MRSA生物膜同樣有效，并且使用優(yōu)選分子HS(Naeg)₂₀連續(xù)刺激細(xì)菌834代未產(chǎn)生耐藥性；在小鼠全皮層感染模型、角膜炎模型和腹膜炎模型中，HS(Naeg)₂₀顯示出與最后一線抗生素萬古霉素相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)抗MRSA感染效果。

圖1. 設(shè)計(jì)并合成具有抗MRSA活性的類肽聚合物

  作者研究了不同端基類肽聚合物對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌的體外抗菌活性，所有聚合物均展現(xiàn)出有效抗菌活性，其中硫醇封端的類肽活性最好。進(jìn)一步合成了不同鏈長(zhǎng)的硫醇封端類肽分子HS(Naeg)_n，發(fā)現(xiàn)類肽分子對(duì)S.aureus ATCC6538的抗菌活性具有鏈長(zhǎng)依賴性，其中20和40 mer鏈長(zhǎng)類肽分子的抗菌活性更優(yōu)。最終，通過對(duì)比研究?jī)煞N鏈長(zhǎng)聚合物對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)HS(Naeg)₂₀具有更低的溶血和細(xì)胞毒性以及更高的選擇性。進(jìn)一步研究表明，HS(Naeg)₂₀對(duì)其他耐藥甚至多重耐藥的臨床分離菌株都具有高抗菌活性，并且在模擬生理環(huán)境的血清或鹽的存在下，HS(Naeg)₂₀的活性幾乎保持不變。

圖2.類肽聚合物具有優(yōu)異的體外抗菌性能

  為研究類肽聚合物的抗菌機(jī)理，作者進(jìn)行細(xì)菌質(zhì)膜去極化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HS(Naeg)₂₀對(duì)金黃色葡萄球菌僅顯示出較弱的膜去極化作用。使用熒光分子標(biāo)記的聚合物Dye(Naeg)₂₀通過熒光共聚焦顯微鏡觀察其殺菌過程發(fā)現(xiàn)，Dye(Naeg)₂₀并未在細(xì)菌膜表面富集，而是直接穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞質(zhì)中富集約300 s后，PI進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部表明細(xì)菌膜受損。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HS(Naeg)₂₀與DNA之間有強(qiáng)烈的相互作用，且細(xì)菌與聚合物共孵育后ROS水平在30 min內(nèi)提高了5.5倍。而通過添加抗氧化劑猝滅大量生成的ROS使其降低至細(xì)菌正常水平后，HS(Naeg)₂₀的抗菌活性明顯降低。綜上，作者推測(cè)HS(Naeg)₂₀可能通過與產(chǎn)生高水平ROS和DNA 結(jié)合相關(guān)的復(fù)雜機(jī)制來殺菌。高水平ROS可以通過破壞細(xì)菌膜來殺死細(xì)菌，SEM和TEM表征結(jié)果顯示HS(Naeg)₂₀處理的金葡菌細(xì)胞膜的明顯受損且細(xì)菌內(nèi)容物明顯減少。

圖3.類肽聚合物的抗菌機(jī)理

  通過產(chǎn)生過量ROS和DNA結(jié)合等多重作用機(jī)制， HS(Naeg)₂₀與傳統(tǒng)抗生素相比，在治療抗生素耐藥細(xì)菌以及生物膜感染和解決細(xì)菌耐藥性方面顯示突出優(yōu)點(diǎn)：1）連續(xù)使用HS(Naeg)₂₀刺激細(xì)菌834代，細(xì)菌沒有產(chǎn)生耐藥性，而對(duì)于抗生素刺激的細(xì)菌很快獲得高達(dá)1024倍的耐藥性；2）與抗生素相比，HS(Naeg)₂₀具有更快的殺菌動(dòng)力學(xué)；3）HS(Naeg)₂₀對(duì)MRSA休眠細(xì)菌同樣具有滅殺能力，而抗生素則無效；4）HS(Naeg)₂₀能夠抑制MRSA生物膜形成，并且有效根除抗生素高度耐藥的生物膜。

圖4. 類肽聚合物具有不易產(chǎn)生耐藥性、快速細(xì)菌滅殺、根除休眠細(xì)菌和生物膜的能力

  作者評(píng)估了HS(Naeg)₂₀在小鼠體內(nèi)抗耐藥菌感染的效果。在小鼠全皮層傷口感染模型中，作者使用了MRSA、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌三種耐藥陽(yáng)性菌，結(jié)果表明，HS(Naeg)₂₀均顯示出相當(dāng)甚至優(yōu)于最后一線抗生素萬古霉素的體內(nèi)殺菌活性。此外，在MRSA角膜炎傷口感染模型中，HS(Naeg)₂₀治療后小鼠眼睛的細(xì)菌明顯減少，而萬古霉素則無效。

圖5. 類肽聚合物在小鼠全皮層傷口模型和角膜炎模型中顯示出體內(nèi)抗菌功效

  作者進(jìn)一步使用腹膜炎模型評(píng)估了類肽分子對(duì)小鼠全身性感染的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MRSA、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌三種耐藥陽(yáng)性菌感染的腹膜炎模型中， 通過HS(Naeg)₂₀腹腔單劑量治療均能大幅度提高感染小鼠的存活率，小鼠主要器官、血液和腹腔液中的細(xì)菌負(fù)荷分析發(fā)現(xiàn)，HS(Naeg)₂₀殺菌效果與萬古霉素相當(dāng)。體內(nèi)毒性研究表明，HS(Naeg)₂₀給藥后小鼠肝臟和腎臟的臨床重要生物標(biāo)志物沒有明顯差異，在組織學(xué)分析中也沒有觀察到明顯的組織損傷。綜上，在多種耐藥陽(yáng)性菌感染的多種動(dòng)物模型中HS(Naeg)₂₀均顯示出有效的體內(nèi)抗感染效果。

圖6. 類肽聚合物在小鼠腹膜炎模型中顯示出體內(nèi)抗菌功效同時(shí)沒有明顯體內(nèi)毒性

  盡管類肽已被作為宿主防御肽抗菌模擬物來探索，用以應(yīng)對(duì)抗生素耐藥性細(xì)菌感染的巨大挑戰(zhàn)。然而，固相合成成本高、耗時(shí)長(zhǎng)且難以大規(guī)模合成的缺點(diǎn)，阻礙了類肽的發(fā)展應(yīng)用。作者通過α-NNCA一鍋法開環(huán)聚合制備的抗菌類肽聚合物，具有低成本、容易大規(guī)模合成、結(jié)構(gòu)多樣性等優(yōu)點(diǎn)。重要的是，優(yōu)選類肽分子在多種動(dòng)物模型中均展示出高效的體內(nèi)抗感染效果，結(jié)合其不易產(chǎn)生耐藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)，使其在抗耐藥微生物感染領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

  華東理工大學(xué)博士研究生謝佳洋和周敏博士是該論文的第一作者，華東理工大學(xué)劉潤(rùn)輝教授是通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部等基金的資助。

  論文鏈接: https://www.nature.com/articles/s41467-021-26221-y