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暨南大學(xué)劉明賢教授課題組：定向孔結(jié)構(gòu)殼聚糖/膠原/埃洛石復(fù)合止血敷料
2023-04-04  來源：高分子科技

  大出血和傷口感染是導(dǎo)致在戰(zhàn)場上、日常生活中死亡的關(guān)鍵原因。常見的止血敷料由于吸血過量而導(dǎo)致不必要的失血量。同時，細菌感染很大程度上延緩了傷口愈合的進程。因此，開發(fā)高性能的止血材料在醫(yī)學(xué)上具有重要的應(yīng)用意義。


  近日，暨南大學(xué)劉明賢教授課題組通過定向冷凍干燥技術(shù)和非對稱性設(shè)計，整合埃洛石納米管（HNTs）、殼聚糖（CS）和膠原蛋白（CO）制備具有快速有效止血性能、抑菌性、生物相容性的止血敷料(CS1N1-1‰CO)。該研究成果以“Engineering Design of Asymmetric Halloysite/Chitosan/Collagen Sponge with Hydrophobic Coating for High-Performance Hemostasis Dressing”為題發(fā)表在國際學(xué)術(shù)期刊International Journal of Biological Macromolecules（影響因子8.025， 中科院一區(qū)）雜志上。該論文以暨南大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院2021級碩士研究生林曉瑩為第一作者，劉明賢教授為唯一通訊作者。


  殼聚糖/膠原/埃洛石復(fù)合海綿是通過溶液共混-冷凍干燥法制備，制備流程圖如圖1A所示。將埃洛石和殼聚糖混合液置于模具中進行定向冷凍，液氮作為冷源，提供自下而上的溫度梯度來定向冷凍懸浮液。冰晶沿著冰凍方向生長，埃洛石和殼聚糖被擠到冰晶之間的界面以實現(xiàn)固液分離。最后通過冷凍干燥，冰晶通過升華變?yōu)闅怏w，留下軸向高度取向的多孔結(jié)構(gòu)（圖1B）。SEM圖也可以看出，埃洛石均勻分布在殼聚糖中。圖1C中，HNTs特有的Al和Si元素均勻分布也說明了這一點。 


圖1 定向冷凍干燥法制備埃洛石/殼聚糖復(fù)合海綿的流程圖和CS和CS1N1的橫截面和縱切面SEM圖。


  圖2A 展示了埃洛石、殼聚糖、膠原蛋白相互作用的機理。殼聚糖和膠原蛋白上含有氨基和羥基，能與埃洛石上的鋁羥基和硅羥基發(fā)生氫鍵作用。殼聚糖和膠原蛋白帶正電與帶負電的埃洛石發(fā)生靜電吸引，使得他們之間具有良好的界面相互作用。圖2B的SEM 和圖2D的TEM直觀地展示了埃洛石、殼聚糖、膠原蛋白三者相互作用的結(jié)果。純的埃洛石是中空的管狀結(jié)構(gòu)，邊緣清晰可見，而復(fù)合海綿中埃洛石表面包覆了一層有機層，使管邊緣變得模糊。這表明埃洛石和高分子接觸時，殼聚糖和膠原蛋白能夠吸附于埃洛石的外表面。另外，XRD、FTIR、ζ電位也證實了這一點。 


圖2 埃洛石、殼聚糖和膠原蛋白的相互作用機制和表征。


  為了比較定向與非定向冷凍干燥海綿吸收液體速率及吸收量，相同體積的海綿分別吸收了全血、血清、細胞培養(yǎng)基。圖3A可以看出，定向冷凍干燥的海綿在10 s時已經(jīng)吸收了大部分血液，30 s時吸收基本完畢。不管吸收何種溶液，定向海綿表現(xiàn)出較大的吸收量和較快的吸收速率。這得益于定向冷凍技術(shù)賦予了海綿軸向有序、規(guī)則的孔隙通道，使海綿具有更高效的液體傳輸速率，這有助于在傷口大量出血時快速吸血。圖3F比較了CS, CS1N1 and CS1N1-1‰CO的密度、孔隙率和吸水能力，埃洛石的加入提高了殼聚糖海綿的密度和孔隙率？紫堵适侵寡罅系囊豁椈拘阅，具有高孔隙率的海綿具有較大的表面積，有利于血紅細胞的黏附和富集。同時，孔隙互聯(lián)能夠提供氧氣和營養(yǎng)，為細胞提供良好的生理環(huán)境，有利于傷口保持在潮濕的環(huán)境中，并促進細胞增殖和傷口愈合。CS1N1-1‰CO敷料具有生物可降解性（圖3E）和抑菌性（圖3I），對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)出高達99%的抑菌率（圖3J），有助于減少傷口相關(guān)并發(fā)癥以防止傷口受外部細菌感染，從而達到更好的止血和傷口愈合。 


圖3 定向埃洛石/殼聚糖/膠原蛋白的性能。


  圖4A 展示了非對稱性海綿的制備過程，通過在海綿的一面涂布一層PDMS，達到非對稱性的效果。為了測試PDMS疏水層對血液的阻隔情況，未涂布PDMS的海綿血液流失量達到73.5%，而非對稱性的海綿在吸血飽和后能在較長的一段時間內(nèi)兜住血液不讓其往下流。圖4E疏水面水接觸角在15 min內(nèi)僅從122.4o降低到109.4o，也證實了疏水面的疏水穩(wěn)定性。同時，涂布PDMS的海綿仍保持一些孔隙（圖4D），維持了止血敷料的透氣性。因此，PDMS涂層既能防止血液的反滲透，阻擋外界物質(zhì)通過孔道進入傷口，降低傷口受感染的風(fēng)險，還能維持止血敷料的透氣性，創(chuàng)面的空氣流通還可以促進凝血因子、血小板、纖維蛋白的聚集從而達到凝血。 


圖4 非對稱性復(fù)合海綿的結(jié)構(gòu)和性能。


  作為與傷口直接接觸的材料，良好的生物安全性和細胞相容性是必不可少的。采用L929細胞（小鼠成纖維細胞）測定細胞相容性。用AM/PI進行熒光染色，如圖5A所示，梭形細胞均勻分布，如圖5B，在不同濃度的海綿浸提液的培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h和48 h，采用CCK-8檢測試劑盒檢測細胞活力，各組細胞活力均超過80%。圖5D中，復(fù)合海綿溶血度均低于5%，具有較好的血液相容性。圖5E凝血行為和圖5G凝血指數(shù)(BCI)表明CS1N1-1‰CO海綿具有較好的凝血性能。 


圖5非對稱性海綿的細胞相容性和止血性能。


  為了評估P-CS1N1-1‰CO海綿的止血性能，作者采用了SD大鼠股動脈損傷模型。圖6B中，血液能迅速滲透到紗布的外層，而非對稱性的海綿血液沒有滲透出來，外部的疏水層幾乎是干凈的。利用定向冷凍干燥方法賦予海綿軸向有序的孔道結(jié)構(gòu)快速吸收血液，而疏水層能防止血液潤濕或過度滲透，達到促進血液凝固，減少失血量的效果。失血量和凝血時間都是令人滿意的，尤其是CS1N1-1‰CO。P-CS, P-CS1N1, and P-CS1N1-1‰CO敷料的失血量分別為4.49 ± 0.14 g, 2.67 ± 0.77 g, 1.85 ± 0.30 g, and 1.52 ± 0.68 g (圖6C)，凝血時間分別為 279 ± 9 s, 210 ± 30 s, 190.5 ± 42.5 s, and 164 ± 24.54 s（圖6D）。 


圖6 敷料對大鼠股動脈損傷的止血性能。


  總之，該工作開發(fā)并證明了一種基于殼聚糖的非對稱疏水性和定向冷凍干燥技術(shù)的具有快速凝血和防止血液反滲透的傷口止血敷料的設(shè)計策略。具有疏水涂層的不對稱傷口敷料顯示出高效止血能力、生物相容性和抗菌性能，在傷口愈合中具有廣闊的應(yīng)用前景。


  該研究得到了國家自然科學(xué)基金（52073121）、廣東省自然科學(xué)基金（2019A1515011509）、廣州市科技計劃（202102010117）、中央高；A(chǔ)研究基金(21622406)、佛山國家高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)產(chǎn)業(yè)化創(chuàng)業(yè)團隊計劃項目組(2220197000129)、廣東省重點領(lǐng)域R&D計劃（2022B1111080007）、廣州市重點領(lǐng)域研發(fā)計劃(202103030003)的資助。


  論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813023010425

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